荧光寿命测量
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荧光寿命测量

荧光寿命通常来讲是绝对的,不受激发光强度、荧光团浓度等因素的影响,仅仅与荧光团所处的微环境有关,因此,利用荧光寿命显微镜(Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)对样品进行荧光寿命成像,可以对样品所在的微环境中的许多物理参数如氧压、溶液疏水性等及生物化学参数如pH值、离子浓度等进行定量测量。此外,荧光寿命成像技术还可以同时获得分子状态和空间分布的信息。


在激发光源的照射下,一个荧光体系向各个方向发出荧光,当光源停止照射后,荧光不会立即消失,而是会逐渐衰减到零。荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回到基态之前,在激发态的平均停留时间。处于激发态的荧光分子在退激发到基态的过程中发射荧光释放能量,激发态荧光团荧光强度的衰减用数学式可表达为单指数函数:
 荧光发射和荧光寿命的工作原理及常见时间分辨荧光寿命测量技术简介       
其中,I(t)是样品受到光脉冲激发后t时刻测量到的强度;I0是t=0时的强度;τ是平均荧光寿命且为分子的特征值,定义为荧光强度衰减到初始值I0的1/e(37%)时所需要的时间。实际上,由于荧光的发射是一个统计的过程,很少有荧光分子恰好在τ(荧光寿命)时刻发射荧光,因此,荧光寿命仅反映荧光强度衰减到其起始值1/e所需要的时间。此外,用仪器观察到的荧光寿命τ与激发态S1的寿命等价,不仅会受到荧光发射速率的影响,还会受到各种非辐射过程的影响,因此,用仪器直接测量到的表观荧光寿命也称作自然寿命。

荧光寿命的测量方法主要有时域法和频域法,时域法荧光寿命的测量主要有时间相关单光子计数法(time correlated single photon counting, TCSPC)、门控探测法(time-gated detection)、条纹相机测量法(streak-FLIM)、频闪技术等四种常见的方法。频域法荧光寿命的测量主要是调制技术。


调制技术是用强度按照正弦规律调制的激光激发样品,由于发射光是激发光的受迫响应,因此,发射光和激发光具有相同的角频率(ω),所以荧光发射的强度也是按照正弦调制的,而且两者的调制频率相同,不过,由于激发态的微小时间停滞——荧光寿命,调制后的发射波在相位上滞后激发波一个相位角φ。此外,相对于激发波,由于发射波也被部分解调,因此,其振幅比激发波的振幅要小,如下图所示。

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实验上,通过测量荧光相对于激发光的相位差φ及解调系数M(发射波振幅与激发波振幅之比),然后通过计算公式便可计算出来相寿命(τp)和调制荧光寿命(τM)。命(τp)和调制荧光寿命(τM)。
下图是频域法荧光寿命测量的原理图。


荧光发射和荧光寿命的工作原理及常见时间分辨荧光寿命测量技术简介

假设荧光相对于激发光的相移为φ,调制系数为M,那么荧光寿命的计算公式为
 荧光发射和荧光寿命的工作原理及常见时间分辨荧光寿命测量技术简介               (1)
其中,ω为调制角频率,φ为荧光相对于激发光的相位延迟,τ是荧光寿命。
荧光发射和荧光寿命的工作原理及常见时间分辨荧光寿命测量技术简介           (2)
其中,Mex是激发光的调制度,而 Mf是荧光的调制度。对于单组分指数衰减,τΦ=τM。当进行实验测量时,首先需要利用那些荧光寿命已知的样品或散射光对系统进行标定。

从上述公式(1)和(2)来看,相移φ和调制度M都可以用来测量荧光寿命,只不过实际中,相位的测量比调制度的测量会更加精确,因此,测量荧光寿命通常采用测量相位差的方法。对于不同的样品可以选择不同的调制频率(一般是荧光寿命的倒数),从而可扩大荧光寿命的测量范围。


下图是单通道调制技术的示意图,连续激光器发出的激光经调制到30 MHz-1 GHz后,激发样品产生的荧光用PMT或光电二极管探测,探测器信号的交流部分被放大输入到混频器,分别与0°和90°相移的调制信号混合。混频器输出的信号经过低通滤波器后可以计算出来相位差。在高频的时候,由于部分混频器不能良好的工作,在实验中,可以采用外差法降低输入到混频器的信号频率。下图中混频器Mixer和后续的低通滤波器可以用锁相放大器如MFLI锁相放大器、HF2LI双通道锁相放大器、Moku:Lab锁相放大器与相位表等直接取代进行测量。

单通道调制荧光.png

单通道调制技术对于光源的选择:
单光子激发——选择调制的激光二极管或者带有外部调制器的可调连续激光器
双光子激发——可以选择钛蓝宝石激光器

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