样品制备是单分子实验的关键步骤，包括钝化微流体样品室、固定分子和设置实验缓冲条件。 实验的效率取决于样品制备的质量和速度，这通常是手动进行的并且依赖于实验者的经验。 这可能会导致单分子样品和时间的利用效率低下，特别是对于高通量应用。 为了解决这个问题，提出了一种压力控制微流体系统来自动化单分子样品制备。 该硬件基于 ElveFlow 的微流体组件，设计成本效益高且适用于各种显微镜应用。 该系统包括一个储液池压力适配件和储液池支架。 对两种流动室设计 Ibidi μ-slide 和 Grace Bio-Labs HybriWell 室进行了表征，并使用 CFD 模拟来模拟不同体积流速下液体的流动特性，并与实验值和理论值进行比较。 这项工作的目标是建立一个简单而强大的单分子样品制备系统，可以提高实验效率并减少手动样品制备的瓶颈，特别是对于高通量应用。
（左）生物素-BSA 和（右）PEG-生物素的固定程序示意图。 后者包括 PEG 钝化过程的示意图
如今，微流体在生命科学的众多领域中发挥着核心作用，用于样品制备和使样品适应各种实验条件。 我们使用微流体技术为专注于荧光显微镜的单分子实验进行自动样品制备。 全内反射荧光 (TIRF) 和共焦显微镜这两种类型之间存在基本区别。 在这两种情况下，所需的荧光信号都与不需要的背景信号分离，例如自发荧光、激发（散射）光等。这可以通过 TIRF 中高达几百纳米的低穿透深度或通过共焦显微镜中的小激发和检测体积以及使用阻挡滤光片（例如利用斯托克斯位移的二向色镜）来实现。 因此，可以实现小样本量，从而可以检测单个荧光标记的生物分子，例如核酸、蛋白质 和脂质，以研究其结构 和动力学 超出总体平均值。 单（生物）分子检测需要各种通常耗时、重复且容易出错的准备步骤。 它们的精确执行对实验的成功做出了决定性的贡献。
样品本身和样品室的制备通常由经验丰富的研究人员手动进行。 然而，这种手动完成的样品制备具有明显的缺点，例如工作步骤复杂繁琐，既耗时又增加了每个步骤的污染风险。 此外，尽管协议的优化被认为是一项要求和必要性，但文献中尚未充分讨论工件、错误和方法之间的再现性和相关性。 为了提高重现性并节省时间，我们的目标是开发一种易于应用且全自动的样品制备程序。
软件控制的自动化微流体系统已成为一种多功能工具，用于为荧光显微镜和光谱应用提供和更改缓冲液。 其中，蠕动泵和注射泵被频繁使用，并且能够为大量通道提供大范围的体积流量。 为了分别提供多种解决方案，需要多个泵或注射器，从而导致设计复杂且昂贵。 商用注射泵可装载多达十个注射器，提供对各种通道的单独控制。 注射泵的局限性是体积流量和压力的波动以及非常小体积（μL）的输送有限。 后者是通过微升注射器实现的，该注射器不仅价格昂贵，而且通常总体积较小（1 mL），导致用户频繁干预。 蠕动泵的小型化及其在微流控芯片上的实现彻底改变了芯片实验室应用，但导致了复杂且昂贵的芯片设计。
在这里，我们提出了一种压力控制的微流体系统，该系统允许以几乎恒定的体积流速进行多通道 μL 体积应用，从而实现单分子荧光实验中所有步骤的自动化：1. 样品室的钝化，2. 样品的固定，3. 各个实验的缓冲液和成像条件的设置 。 我们以现有的商用系统OB1（ElveFlow Elvesys，法国）为基础，并将其应用于单分子实验。 压力控制装置的优点是对各个样品和缓冲液储存器的控制相对简单且自动化，可用通道数量多而无需更多泵，以及将所有储液池轻松紧凑地连接到一根最终离心管中而无需进一步的使用手动阀。 后者减少了总死体积和由于滞留气泡而产生错误的可能性。 该系统由一个多通道压力控制器OB1组成，OB1的压力通道输出所需要的压力，通过多孔歧管将压缩空气分配到不同的储液池，即微反应管（这里也称为 Eppendorf 管），从而控制从储液池到微流体管道系统的体积流量。 下游收集器将所有储液池集中到一根管子中，该管子连接到样品室。 这允许以时间和体积控制的方式将不同的缓冲液和样品介质依次注入样品流动室。 压缩空气的压力被传递到储液池的微反应管，从而通过适配器传递到管道系统。施加的压力 p 控制体积流量 𝑉，并且相应的实验确定储液池适配器的数量，即通道数 n 和所需的压力。
上图是压力控制单分子样品制备系统，其基于 ElveFlow 的高精度压力流量控制系统。 该系统在硬件和软件方面进行了调整，因此可以扩展到多达九个缓冲储液池，无需额外成本即可进行单分子样品制备，包括钝化和固定。 通过结合流量传感器、气泡捕捉器和阀门系统，可以实现制备过程的完全自动化。
控制软件ESI。 压力控制器OB1 、MUX 分配阀和 MUX WIRE控器均通过 USB 连接到工作站并由控制软件ESI进行配置。控制软件“ESI”允许顺序通道选择以及精确的流量 𝑉 和压力 p 控制。 该软件提供多种功能，包括可定制的序列协议以及微流体系统内实验参数（流速和压力）的实时监控。 这允许完全自动化的单分子实验，其中在样品制备过程中精确控制体积流速和各自缓冲液的顺序非常重要。
自动化样品制备
我们遵循单分子荧光实验的标准方案，首先是 1) 使用生物素-BSA 或生物素-PEG 进行表面钝化，然后是 2) 样品固定和 3) 调整成像缓冲液条件。 该程序以形成 Cy3 和 Cy5 的标准双链体为例，该双链体携带 44nt 长的 DNA 寡核苷酸，并具有用于表面固定的 5' 端生物素功能化。
为了确保成功的自动化样品制备，流动室中的流速 v 必须相当低，以保持钝化和固定完好。 理论流速由施加压力 p 的函数并使用流动模拟确定。为确保稳定的压力控制范围，需使用内径非常小的阻力管。下图显示了理论体积流量和室内流速与施加压力的关系。
在两个室（Grace Bio-Labs HybriWell 和 Ibidi μ 载玻片）中对数千个固定单分子（1 nM Cy3 和 Cy5 标记的生物素化 DNA 寡核苷酸）进行 TIRF 图像采样，并使用 BSA-生物素钝化。 下图显示了未经 BSA 钝化但运行完整预处理和准备序列的 HybriWell 室的 TIRF 图像以进行比较。
Pressure-controlled microfluidics for automated single-molecule sample preparation来自于Anxiong Yang, Falk Nicolas Lein, Joana Weiler, Julian Drechsel, Vanessa Schumann, Felix Erichson, André Streek, Richard Börner于2023年4月发表在Hardware X期刊上的高质量论文。
更加详细的信息请参见从Hardware X官网下载该论文。
